《自然-方法》发表脑智卓越中心关于新型RNA编辑工具开发及其优化的研究成果

发布时间:2021-05-04

  CRISPR/Cas13是一类RNA介导的靶向RNA切割的系统,它被广泛地应用于RNA敲低、RNA单碱基编辑、RNA定点修饰、RNA活细胞示踪以及核酸检测领域。相比于传统的RNA干扰技术,Cas13系统具有更高的敲低效率和特异性;相比于Cas9介导的DNA编辑技术,Cas13不会对基因组造成永久性改变,甚至可以通过药物来调控RNA编辑,使其具有可逆性,因此在疾病治疗上具有比较独特的优势。2015年,美国Eugene Koonin实验室和张锋团队合作,利用计算生物学方法在微生物宏基因组数据库中发现了Cas13a(c2c2),Cas13b(c2c6)Cas13c(c2c7)三种系统,并证明了这些系统在哺乳动物细胞中可以对靶RNA进行高效地敲低。张锋团队对Cas13RNA脱氨酶ADAR2进行改造,将其应用于哺乳动物的RNA单碱基编辑。2018年,张锋的学生毕业后报道了Cas13d系统,相对于之前的系统,Cas13d蛋白减少了100200个氨基酸。其中, RfxCas13d展现了最佳的敲低效率,加上体积小的优势使得它广受领域内研究者的追捧。虽然RfxCas13d只有967个氨基酸,但是整个系统已接近单个AAV的装载极限,而基于Cas13dRNA单碱基编辑工具则更难用单个腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体进行递送,因此开发更小的、高效的RNA编辑工具对临床转化具有重要意义。 

  202153日,《Nature-Methods》期刊在线发表了题为《利用未获培养的自然微生物中发现新型紧凑型CRISPR-Cas13系统进行可编程RNA编辑》的研究论文,该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和中国农业大学农学院赖锦盛团队合作完成。该研究通过对微生物大规模宏基因组数据进行计算分析发现两类新的CRISPR/Cas13系统,通过功能实验和工程化改造开发了一套高效率、高特异性的RNA编辑工具,该工具对开发基于RNA编辑的基因治疗手段具有重要的促进作用。 

  最近报导的Cas13系统都是从可培养的微生物基因组数据中挖掘的,然而自然界中90%的微生物都是不可培养的,因此,杨辉团队这次把目标聚焦在挖掘未获培养的自然微生物宏基因组数据。该研究通过精巧的计算生物学算法和实验设计,鉴定到了两个新的Cas13家族,并命名为Cas13XCas13Y,其中,Cas13X.1蛋白比常用的RfxCas13d蛋白还要小将近200个氨基酸,为目前最小的Cas13蛋白。通过对大量内源基因位点进行敲低实验,Cas13X.1展现了和RfxCas13d一样的高活性和高特异性。为进一步研究Cas13X.1在抗RNA病毒方面的应用潜力,团队成员对病毒基因组上多个位点进行靶向切割,发现Cas13X.1在体外展现了良好的病毒抑制效果。最后,杨辉团队将突变的Cas13X.1ADAR2dd进行融合,并做了一系列蛋白截短改造,开发了一种迷你型的RNA单碱基编辑工具,通过与之前报道的RNA单碱基编辑系统进行比较发现,基于迷你型Cas13X.1蛋白的RNA单碱基编辑系统(miniCas13X-ADAR2dd)可以对靶RNA进行高效的AICU的编辑。同时,miniCas13X-ADAR2ddREPAIRRESCUE系统小将近900aa,可以包装到一个AAV里面。此外,全转录组分析显示,迷你碱基编辑器脱靶活性极低,是一项高保真的碱基编辑技术。 

  值得一提的是,目前Cas13系统应用于临床最大的障碍是Cas13蛋白本身的旁切活性(collateral activity,RNA激活的非靶标RNA切割活性)。已有证据表明Cas13d的旁切活性会对动物细胞和个体产生一定毒副作用。虽然Cas13X.1在体外切割实验中显示了比Cas13aCas13d更低的旁切活性,但是Cas13X.1的进一步改进,以及体内的长期安全性评价,对于Cas13X.1的最终临床应用至关重要。 

  该工作成功从未获培养微生物宏基因组数据中鉴定到了两个新的Cas13系统,极大地丰富了Cas13家族的多样性。而且通过大量实验证明了Cas13X.1RNA编辑方面具有非常大的应用潜力,小尺寸很好地解决了Cas13体内递送的问题,有望在未来成为一种高效安全的RNA治疗方法,为疾病(尤其是罕见病)的基因治疗提供更多的选择。 

  该项工作由中科院脑智卓越中心博士后胥春龙、周英思和博士研究生肖庆全、博士后贺冰冰与耿冠男等研究人员,在中科院脑智卓越中心杨辉研究员、周英思博士和中国农业大学农学院赖锦盛教授的指导下完成,研究组的博士后汪子康、董雪、研究生曹碧蓉和本科生王一凡等其他成员积极参与,并得到了脑智卓越中心流式分选和高性能计算集群平台的大力协助。本工作得到科技部、基金委、中科院、上海市的资助。 

 

  1:从未获培养的自然微生物宏基因组数据挖掘新的Cas13蛋白应用于哺乳动物与病毒RNA的敲降。a, 构建新挖掘的Cas13X, Cas13Y蛋白与前人报道的 Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d蛋白的进化树。 括号展示了常见的Cas13蛋白及其大小。标尺展示了大小为0.5的相对遗传距离。b, Cas13XCas13Y相关CRISPR系统的基因座示意图。蓝色和绿色长方形分别表示Cas13CRISPR重复单元。灰色菱形表示间隔序列。c, Cas13X.1介导高效的多重RNA敲降。 d, , SARS-CoV-2SARS-CoV-1以及 SARS-CoV-2 与所有冠状病毒基因组序列的比对结果. , SARS-Cov-2病毒RNA敲降的报告系。下, 病毒RNA敲降结果。 

 

  2:开发基于Cas13X.1的迷你型RNA碱基编辑器应用于高效的AICU碱基替换  a, 基于dCas13X.1RNA腺苷酸编辑器xABE以及碱基编辑报告系统示意图。b, 预测的Cas13X.1 ADAR2dd蛋白结构。黄色和绿色分别表示Cas13X.1N端与C, 红色代表HEPN基序, 橙色表示ADAR2ddc, xABE截短突变体的效率检测结果。d, 全长与迷你xABE及过去报道的ABEAI编辑效率的比较结果。e, 全长与迷你xCBE及过去报道的CBECU编辑效率的比较结果。f, 迷你xABE/xCBE显著降低全转录组的RNA脱靶编辑。 

    

    

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