开发图谱绘制新技术
严军团队自主开发了名为Gapr的新一代大规模单神经元重构系统。Gapr创新地整合了基于深度学习的全自动重构、多用户同时参与协同校对、高效响应用户需求的图像数据处理等多种功能，大幅提升神经元重构的效率。Gapr的开发对推动全脑介观神经联结图谱的绘制具有重要意义。相关研究成果发表在Nature Methods杂志。
图 神经元重构系统新架构Gapr
a，Gapr的五个模块，包含图像数据处理的Convert模块，自动重构的Trace模块，协同重构服务器端的Gather模块及人工校对的Proofread和Fix模块；b，响应用户需求的图像数据处理；c，Gapr的神经元模型，与SWC文件格式兼容。
2、单细胞标记和成像方法开发
在联合实验室资助下，研究人员通过多维同步三维飞扫荧光显微成像技术（VISoR）结合组织透明化与半自动追踪（SMART）流程，实现猕猴全脑微米精度的高通量成像，完成猕猴运动皮层神经元单细胞全脑投射轴突的三维重构。相关研究成果发表在Neuroscience Bulletin杂志。
图 猕猴神经元稀疏标记和全脑成像
介观神经联接图谱的功能研究
大脑神经元具有复杂多样的细胞类型。细胞类型的精确定义对解析大脑神经环路连接与功能具有关键作用，最终将帮助我们更好地理解神经系统的工作原理。全脑投射谱分析揭示了单个神经元往往具有多个目标投射脑区。这些多目标投射的特征给特定神经元类型的功能提供了结构基础，但目前还欠缺能够基于多种投射特征精确标记、记录和操控特定细胞类型的分子工具。徐春团队运用intein内含肽介导的蛋白剪接技术，在神经细胞内实现控制子（tTA）蛋白水平组装。此组装具多条件交叉特性，可驱动效应基因表达，用于多特征神经元特异性标记与功能研究。该研究开发出标记、记录、操控多特征神经元的新型分子工具，揭示腹侧海马神经元投射与情绪编码关系，为解析复杂神经环路提供精细且广泛适用的工具集。 相关研究成果发表在Nature Communications杂志。利用这些技术，徐春团队解析了海马长轴环路对记短期维持的神经机制。由此，介观联接的结构与功能连接进入了一个新的阶段，即基于单细胞全脑投射谱定义环路和多特征神经元的新阶段。
（A）IBIST工具的质粒设计和工作原理。（B）利用IBIST工具标记接收背侧海马输入的腹侧海马CA1的SOM+中间神经元，表达光遗传蛋白NpHR。（C）黄光操控SOM中间神经元的电活动。（D）利用IBIST工具在投射到4个下游脑区的海马兴奋性神经元（CaMKIIα标记）当中表达钙指示蛋白GCaMP6s。（E）海马神经元的荧光信号和钙反应。
2、猕猴前额叶双光子显微成像技术和序列记功能研究
双光子显微成像技术是非常前沿的投射谱功能检验的实验方法，可以追踪同一群神经元跨实验周期和跨天的神经活动。虽然该技术在小鼠的功能研究当中已经非常广泛应用，但在非人灵长类的应用当中还有非常多的挑战。王立平团队在清醒猕猴进行工作记忆依赖的认知任务时，利用双光子显微成像技术对猕猴前额叶神经细胞活动进行了大规模记录和连续追踪，发现了序列工作记忆的猕猴大脑当中表征的几何结构。该研究发表在Science期刊。
由于双光子显微成像需要在头部固定动物当中进行，然而，导航和场景相关的实验研究需要动物的行走互动。徐春团队设计了高性能的VR装置，并申请获批相关专利。在此基础上，匈牙利合作方Balázs Rózsa团队开发了沉浸式立体视觉的VR设备，并且通过立体视觉更好地模拟真实世界。相关成果发表在Nature Methods期刊。动物在VR当中导航时，Balázs Rózsa团队与合作者一起发现了局部环路放大空间信息的海马环路机制。相关成果发表在Nature期刊。
Balázs Rózsa团队还开发了对锌离子成像的探针，并和双光子显微成像适配。相关成果发表在Chemistry: A European Journal 杂志。研究团队利用声光显微成像技术研究行为动物大脑皮层稀疏神经网络及广泛树突分支结构的功能，结合听觉辨别与检测任务，对稀疏中间神经元群体的树突和胞体进行成像。研究揭示了来自多个脑区、此前尚未被揭示的亚细胞层面机制及网络作用机制。相关成果发表在Biophotonics Congress: Optics in the Life Sciences 专著当中。
图 在头部固定动物上产生立体视觉的VR设备
研发新型脑疾病治疗方法
联合实验室还致力于研究新型的脑疾病治疗方法。我们重点探索四个方向：一是基因编辑技术，二是干细胞治疗技术，第三是小分子药物的筛选，第四是构建非人灵长类模型的方法。
CRISPR-Cas13是一类由RNA介导的靶向RNA的基因编辑技术。Cas13蛋白本身普遍存在的旁切活性已成为其走向临床应用的最大障碍，如何降低或消除Cas13蛋白的旁切活性显得尤为必要，开发更特异的高保真Cas13蛋白对基于RNA编辑的基因治疗策略研发及后续的临床转化具有重要意义。杨辉团队开发出特异性更高、安全性更好的高保真版Cas13系统。通过对大量内源基因位点进行RNA敲低的实验，hfCas13d表现出与野生型Cas13d同样的高活性。结合体外切割实验、全转录组分析、稳转细胞系、转基因小鼠、在体靶向RNA敲降等技术，对hfCas13d进行了系统性的脱靶效应验证及安全评估。综合而言，此项工作开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13d蛋白变体，这一新工具显示出更高特异性，而且在基因治疗方面具有更好的安全性。该成果发表在Nature Biotechnology杂志。
图 高保真Cas13蛋白的工程化设计、筛选及脱靶效应验证
干细胞治疗技术在基础和应用研究当中都有广阔应用前景。小鼠胚胎干细胞注射到囊胚并形成嵌合体的技术是构建遗传修饰小鼠模型的关键技术。然而非人灵长类胚胎干细胞嵌合体研究一直进展缓慢。 刘真团队以封面文章的形式在Cell期刊发表研究论文，并申请了相关专利，包括国际专利。该研究在国际上首次成功构建了高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴，并证实了猴胚胎干细胞可以高效的贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。这对于理解灵长类胚胎干细胞全能性具有重要意义，为遗传修饰模型猴的构建奠定了技术基础。
人多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，为细胞治疗提供了大量的可再生的细胞资源。然而，目前的干细胞分化技术还有不少局限：体外分化得到的移植用供体细胞存在高度异质性；供体细胞移植后，脑内移植物中的目标神经元的比例通常较低；移植物的细胞组成未知。陈跃军团队解析了中脑多巴胺能神经分化的单细胞转录组图谱，发现了中脑多巴胺能神经祖细胞的特异性表面蛋白分子，并且应用它们来获得高纯度的目的供体细胞，实现稳定且可预测的帕金森病细胞治疗结果。研究成果在The Journal of Clinical Investigation期刊发表，进一步推进了神经退行性脑疾病的干细胞治疗方法。
3、小分子药物筛选
张洪钧团队利用生物节律紊乱猕猴模型，与中国科学院药物所合作，筛选多种小分子化合物，发现小分子化合物TPN和ISX可以明显改善节律紊乱猕猴的睡眠障碍和新环境探索行为。目前，该研究成果正在整理投稿过程中。相关成果已经申请了专利。
非人灵长类模型对脑疾病机理解析和治疗方法开发都非常重要，但非人灵长类模型的构建的效率与能量仍然需要不要不断提高。孙强、熊志奇、刘真团队利用外源 FSH 和睾酮，使得15个月龄的实验猴产生正常活力精子。此技术大幅缩短食蟹猴繁殖传代时间，解决精巢异种移植相关问题。科研人员借此加速繁育MECP2 转基因猴和PRRT2基因敲除猴，成功获得相应F1代和MECP2转基因猴F2代。该技术促进了非人灵长类遗传修饰动物模型的应用，相关研究成果发表在National Science Review杂志。孙强、刘真团队进一步构建了恒河猴-食蟹猴杂交猴，建立了适用于杂交猴的数据分析流程，证明了杂交猴在分析等位特异的表达（allele-specific expression，又称ASE基因）上的优势，并通过杂交猴策略得到了脑组织中的ASE基因图谱。相关研究发表在The Innovation杂志。该研究表明恒河猴和食蟹猴杂交后代可被用作研究印记基因的工具，可与多组人类疾病相关的数据库进行联合分析，揭示了特定基因与神经系统疾病的潜在关联性。
